HPLC分析純化合成多肽的方法分享
 

　　分析HPLC使用柱子和泵系統(tǒng)，可以經(jīng)受傳遞高壓，這樣可以用極細(xì)的微粒(3-10μ m)做填料。由此多肽要在幾分鐘內(nèi)高度被分析。
 

　　HPLC分兩類:離子交換和反相。 離子交換HPLC依靠多肽和固相間的直接電荷相互作用。柱子在一定PH范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸組成表現(xiàn)出相反電荷。
 

　　分離是一種電荷相互作用，通過可變PH， 離子強(qiáng)度， 或兩者洗脫出多肽，通常， 先用低離子強(qiáng)度的溶液，以后逐漸加強(qiáng)或一步一步加強(qiáng)，直到多肽火柱中洗脫出。離子交換分離的一個(gè)例子使用強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱。如sulfoethylaspartimide通過酸性PH中帶正電來分離。
 

　　反相HPLC條件與正常層析正相反。多肽通過疏水作用連到柱上，用降低離子強(qiáng)度洗脫， 如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價(jià)吸附到硅上的碳?xì)渫殒湗?gòu)成，這種鏈長(zhǎng)度為G4-G8碳原子。
 

　　由于洗脫是一種疏水作用。長(zhǎng)鏈柱比短鏈對(duì)小的， 高帶電肽好。另一方面大的疏水肽用短鏈柱洗脫好。 然而，總體實(shí)踐中， 這兩類柱互變無(wú)多少顯著差別，別類載體由碳水化合物構(gòu)成， 比如苯基。
 

　　典型的操作常由兩綬沖劑組成，0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile 0.1%TFA--H2o稀acetonitrile。用線型梯變以每分鐘0.5%到1.0%改變的速度混合。常見分析和純化用柱為4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用徑向填柱，那么大小是8×100(3-10μ m)和25×250mm(10μ m)
 

　　大量各種緩沖劑含許多不同試劑，比如heptafluorobutyric酸，0.1%磷酸， 稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3, 醋酸鈉/氨，TFA/TEA，磷酸鈉或鉀，異戊酚。這樣許多不同組合可形成緩沖劑，但要注意一點(diǎn):硅反相柱料不能長(zhǎng)時(shí)間暴露于高pH，甚至微堿pH， 因?yàn)檫@樣會(huì)破壞柱子。
 

　　不要把肽含量和純度搞混了。肽的純度可能是100%， 而肽含量相關(guān)帶電基團(tuán)(如Arg, Lys )的抗離子量和肽親水性決定。這是合成肽的本身特性。